新闻资讯 | 吉康医学研究院——深度剖析外泌体五大热门研究方向

本文由吉康医学学术团队刘涛博士撰文

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外泌体(Exosomes)是一种能被机体内大多数细胞分泌的微小膜泡，具有脂质双层膜，直径大约为30-150 nm。外泌体广泛存在并分布于各种体液中，携带和传递重要的信号分子，形成了一种全新的细胞-细胞间信息传递系统，影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关。几乎所有类型的细胞都可以分泌外泌体，同时外泌体也广泛存在于体液中，包括血液、眼泪、尿液、唾液、乳汁、腹水等。目前研究发现外泌体中富含核酸(MicroRNA、lncRNA、circRNA、mRNA、tRNA等)、蛋白、胆固醇等。外泌体的表面marker主要有CD63、CD81、CD9、TSG101、HSP27等。外泌体的产生过程为：细胞膜内陷，形成内体(Endosome)，再形成多泡体(Multivesicular bodies，MVB)，最后分泌到胞外成为外泌体。外泌体中携带有母细胞的多种蛋白质、脂类、DNA和RNA等重要信息。

外泌体是直径30-100 nm的颗粒，所有类型的细胞都能分泌。这些脂质双层颗粒富含胆固醇、神经酰胺和磷脂酰丝氨酸，其脂质含量与亲本细胞不同。在大多数外体中普遍存在的标志物包括Tetraspanins(CD9、CD63和CD81)；热休克蛋白；粘附分子；以及ESCRT(运输所需的内体分选复合物)途径的标志物，包括LAMP1和TSG101。

一.外泌体简介

1.外泌体内容物

癌症来源的外泌体含大量的内含物，由microRNAs、mRNAs、转录因子、蛋白质和脂质等成。microRNAs是小的、非编码的RNA，通常是20-25个核苷酸的长序列，一旦进入受体细胞，就与目标mRNA序列结合并抑制翻译。已发现miRNA在大多数癌症中表达失调。不同细胞来源的外泌体的miRNA特征是不同的。许多miRNA是肿瘤特异性的，因此可以用作诊断和预后的生物标记物。

外泌体的结构和内含物。外泌体是小的膜结合囊泡，与质膜具有相似的拓扑结构。外泌体携带的脂质双层膜结构含有典型的跨膜蛋白和受体，如跨膜蛋白PGRL、LAMP1/2、CD13，膜转运蛋白如膜联蛋白和RABS蛋白，粘附分子如ICAM-1、乳胶黏附和整合素，脂筏相关蛋白如Flotillins、LBPA、胆固醇、胃素和Tetraspanins，最具特征的是CD63和CD81。此外，胞外体膜表面还组装有免疫调节分子，如MHC-I和-II、CD80和CD86。在外腔内可以找到几种稳定和保存“信息”的外体货物的蛋白质：细胞骨架蛋白，HSPs，最典型的是HSP70，细胞骨架蛋白(Vimentin，cofilin，Tublin，Talin，actin)，代谢酶(GAPDH，A TPase，pgk1)，以及参与MVB形成的蛋白质，如Alixs，Tsg101，clathrin。外泌体的内容物可以在微环境中从原始细胞转移到靶细胞，包括RNA种类(mRNAs、miRNAs和其他类型的短RNA)和大量不同的蛋白质，取决于它们的宿主细胞。

2.外泌体释放途径

外泌体是一类囊泡，其分泌途径包括有效载荷及与血管内皮的融合。有证据表明，有两类血管内皮细胞：富含胆固醇的分泌型血管内皮细胞(SMVEs)和容易与溶酶体融合的低胆固醇血管内皮细胞(LMVEs)。微泡产生于损伤或转化细胞的膜脱落。凋亡小体或凋亡体是从垂死的细胞或凋亡后残留的细胞体中脱落的囊泡。这些EVS的膜脂含量更接近于起源细胞的质膜。外泌体也包括来自高尔基复合体的脂质，使它们与质膜更加不同。

3.外泌体生物标志物

细胞外蟆泡可基于其起源或大小分为凋亡小体、微泡体和外泌体。外泌体是其中最小且最具特征的囊泡，由不同种类细胞分泌释放，包括神经细胞及其起源的肿瘤细胞，在神经系统中发挥重要功能。从血液和脑脊液中提取的外泌体是真核细胞用于交换蛋白质unRNA和微小RZA等生物学信息的载体，这些生物分子参与细胞信号转导、肿瘤细胞增殖迁移及血管生成。外泌体不仅是一种新的生物学标志物检测方法，更可提供潜在的分子治疗靶点，并且有望成为抗肿瘤药物传递的载体。

二.外泌体研究分析

1.外泌体和肿瘤干细胞

近年来，肿瘤干细胞(CSC)模型被提出并受到越来越多的关注。集体研究表明，这些CSCs可以启动肿瘤再生。它们能够自我更新，重现原始肿瘤的异质性，并在免疫功能低下的小鼠身上分化为新肿瘤的整体。

Bonnet和Dick首次证明了人类急性髓系白血病中CSCs的存在。这些细胞与正常造血干细胞相似，可向白血病克隆方向分化。该层次结构与造血祖细胞的分化过程相似，提出了肿瘤治疗中靶向CSCs的必要性。根据研究结果，美国癌症研究协会在2006年提出了对CSC的一致定义，即“肿瘤内具有自我更新能力的细胞，并导致组成肿瘤的癌细胞的异质性谱系”。在杀死快速增殖的癌细胞的传统治疗下，CSCs保持自我更新，并增加肿瘤复发的风险。值得注意的是，集落进化模型还表明，CSCs可能与最初的致瘤细胞不同。在疾病发展过程中，CSCs与茎相关的遗传特征可能会发生一些变异，导致表型和功能的切换。因此，所谓的CSCs的致瘤特性只能用来指它们在异种移植中引起肿瘤的能力，而不能用来解决来源细胞的问题。CSCs是肿瘤发生的根源，具有乳腺干细胞的共同特征，包括静止、自我更新和分化潜能。自我更新能力使BCSC具有有效修复DNA损伤的生存优势，而分化潜能使BCSC具有致瘤能力。微环境成分，包括外体、趋化因子和细胞外基质，也通过与BCSC表面标志物的相互作用在维持表型方面发挥重要作用。这一作用通过细胞内信号将多变的干细胞样属性与不同的肿瘤微环境紧密联系在一起。这些顽固性肿瘤细胞中的异常表达提示CSCs可能是肿瘤体积中免疫抑制机制的重要组成部分。

BCSCs治疗耐药的主要可能机制。这些特征主要包括增强的自我更新能力(Notch、Wnt和HH信号)，增强的抗凋亡能力(PI3K信号)，增强的抗氧化能力(NRF2信号)，增加抗癌药物的外流(ABCG2)，低氧状态(HIF-1信号)，以及肿瘤微环境维持效应(外体或趋化因子)。所有因素共同作用，导致了BCSC的耐药表型。

2.外泌体和自噬

自噬是一种应激反应的分解代谢过程，溶酶体酶通过该过程降解细胞内的成分。现在人们普遍认为，自噬在细胞和组织的动态平衡以及新陈代谢、发育和通过清除病原体而产生的免疫中起着至关重要的作用。有几条降解途径进入溶酶体：一，微型自噬，胞浆物质直接内化到溶酶体后被降解；二，伴侣介导的自噬，通过它胞浆蛋白的子集被选择性地降解；三，宏自噬(以下简称自噬)，处理胞质物质的分离和降解。自噬是由许多不同的生理刺激或病理生理情况引起的。它还在细胞质的质量控制中发挥作用，因为它可以去除蛋白质聚集体、受损的细胞器(例如，有缺陷的线粒体)和细胞内的病原体(细菌和病毒)。自噬参与细胞内成分的水平调节和循环，如氨基酸、脂质(脂滴)和碳水化合物，从而直接促进细胞新陈代谢和能量调节。最后，自噬可以防止与衰老相关的细胞修饰。因此，这个复杂的膜通路，受许多因素调节，参与细胞策略，以保护生物体免受癌症、感染性疾病以及代谢、肌肉、炎症和神经退行性疾病的侵袭。相反，自噬途径的完全或部分失调会加重或导致这些病理。

哺乳动物细胞中的自噬途径。哺乳动物细胞中溶酶体的降解有三条自噬途径：CMA通过与溶酶体表面的蛋白LAMP-2A相互作用将底物转移到溶酶体上。CMA需要底物上的靶向基序(KFERQ)；这个基序由伴侣Hsc70识别。微自噬通过直接内陷溶酶体来隔离货物。宏自噬涉及形成称为自噬小体的双膜细胞器，货物被隔离在其中(起始和延伸步骤)。自噬小体与溶酶体融合，在那里货物被降解(成熟步骤)。自噬途径有三个重要阶段：自噬小体形成的起始阶段(包括吞噬小体的形成)、伸长/闭合阶段(导致封闭的自噬小体的形成)和自噬小体的成熟(包括与溶酶体的融合)。构成ATG蛋白质核心机制的不同模块由虚线分隔。能量耗竭、氨基酸和血清饥饿通过不同的信号通路激活ULK复合体，包括mTOR通路。噬菌体来自内质网的一个区域，称为omegasome。omegasome的特征是存在PI3P结合蛋白DFCP1。PI3P用蓝线表示。还显示了内质网定位的跨膜蛋白VMP1，它与IIIPI3K复合物相互作用。刺激ULK复合体激活这个复合体，它由核心结构(Beclin1，Vps15和Vps34)和两个调节子(ATG14L和AMBRA1)组成。这种诱导允许PI3P的产生促进Wipi蛋白在两个泛素样接合体系统的上游募集，这两个泛素样接合系统延长并封闭了自噬体膜。第一结合系统导致形成ATG12-ATG5-ATG16L1复合物，该复合物在第二结合系统中充当E3样酶，其在未结合形式LC3-I下游产生脂化PE结合形式的LC3(LC3-II)。

自噬和外体之间新出现的相互作用。现有的数据表明，自噬机制和外体生物发生之间存在多种可能的相互作用。(A)自噬机制的子集可能有助于外体的生物发生。作为一个例子，这里显示的是ATG5-ATG16复合物，它定位于MVB并介导LC3B的非正则脂化。ATG5-ATG16复合物还有助于V-ATPase的解离，防止MVB的酸化和随后的溶酶体降解。然后，MVBS与质膜(右)融合，释放外体。(B)两亲体可以与PM融合并分泌其内容物。这里显示的是依赖自噬的膜联蛋白A2(ANXA2)的分泌，其中需要一个两亲体中间体来释放胞质ANXA2在外体中。

3.外泌体和miRNA

自第一个microRNA(miRNA)被发现以来的短短二十多年间，miRNA生物学领域得到了长足的发展。对miRNAs在发育和疾病中的作用，特别是在癌症中的作用的深入了解，使miRNAs成为新的治疗方法的有吸引力的工具和靶点。功能研究已经证实，miRNA失调是许多癌症的原因，miRNA作为肿瘤抑制基因或癌基因(OncomiRs)发挥作用，miRNA模拟物和靶向miRNA的分子(AnttimiRs)在临床前开发中显示出希望。几种miRNA靶向疗法已经进入临床开发，包括一种肿瘤抑制因子miRNA miR-34的模拟物，它达到了治疗癌症的第一阶段临床试验，以及针对miR-122的抗iRs，它达到了治疗肝炎的第二阶段试验。microRNAs(miRNAs)是一类非编码RNA分子，通过与互补靶mRNA结合，导致mRNA翻译抑制或降解，在细胞分化、增殖和存活过程中发挥核心作用。

人类miRNAs的生物发生涉及四种关键酶-DROSHA、Exportin 5、Dizer和Argonaute2(AGO2)的严谨调控通路。编码生物发生途径相关酶的基因突变，如DICER、DROSHA、Exportin 1和AGO2在许多癌症类型中都存在，包括神经母细胞瘤、卵巢癌和肾母细胞瘤。同时，在体内传递RNA分子的技术的进步使基于miRNA的疗法成为可能。这些构建体在其RNA主干上具有各种修饰，以提供更高的稳定性和对核酸酶的保护。在最初的研究中，将裸露的miRNA模拟物，或编码在病毒载体中的miRNA模拟物，系统地或局部地注射到目标组织部位。

miRNA生物发生。microRNA(miRNA)生物发生概述，强调与miRNA改变相关的疾病中起作用的关键突变和非调控因素。miRNA是在一条严谨调控的跨物种保守的途径中产生的。miRNA的生物发生始于RNA聚合酶II的转录。编码miRNA的基因大多位于内含子区域，并含有各自的启动子区域。在RNA Pol II介导的长初级转录本的转录之后，产生成熟miRNA的两个酶切割中的第一个开始。DROSHA是一种III型RNase，与辅因子蛋白Dgcr8一起与初级miRNA(pri-mi RNA)转录本结合。DROSHA中存在的两个RNA酶结构域介导了pri-miRNAs的3个ʹ和5个ʹ链的切割，以产生前miRNA。接下来，exportin 5-Ran·GTP复合体介导前mRNAs从细胞核进入胞浆。在那里，RNaseIII Disher和TAR RNA结合蛋白(TRBP)与前miRNA结合，并切割末端环，产生miRNA双链。下一步，将miRNA双链掺入RNA诱导沉默复合物(RISC)。miRNA双链的处理是由Argonaute(AGO)蛋白家族介导的，与几个辅助因子(如PACT(也称为PRKRA))结合在一起。经过解离和链选择，成熟的miRNA能够识别目标。成熟的miRNA与RISC结合导致具有互补位点的mRNAs靶向，导致翻译抑制或mRNA降解。如图10，14-18所示，编码生物发生途径相关酶的基因突变，如DICER，DROSHA，Exportin 1和AGO2，已在许多癌症类型中被报道，包括神经母细胞瘤，卵巢癌和肾母细胞瘤。

4.外泌体和lncRNA

细胞外小泡(EV)是一种小的膜性小泡，由多种细胞类型分泌，包括凋亡小体、微泡和外泌体。外泌体在多囊内小体或多囊小体(MVB)内产生，并在这些小室与质膜融合时分泌。外泌体通过运输细胞内的成分，如蛋白质、RNA和DNA，促进细胞间的交流。这些外泌体成分在受体细胞中具有功能性，并且随来源细胞的不同而变化很大，细胞在不同的生理和病理条件下可以产生不同的外泌体。大量研究表明，在局部和远处的微环境中，外泌体 是肿瘤细胞和间质细胞之间细胞间通讯的重要媒介。外泌体的表面分子允许它们以受体细胞为靶点。一旦连接到靶细胞上，外泌体通过受体-配体的相互作用诱导信号传递，或者通过内吞和/或吞噬作用被内化。另一方面，外泌体甚至与靶细胞的膜融合，将其内容物输送到其胞浆中。外泌体可以从不同的生物体液中分离出来，例如血液、尿液和唾液。

肿瘤微环境中的间质细胞也利用外泌体转移影响癌症发生和发展的分子内容。MIR-21由网膜肿瘤微环境中邻近间质细胞来源的外泌体递送，赋予转移性卵巢癌细胞恶性表型和化疗耐药性。在乳腺癌中，间充质干细胞(MSCs)分泌的外切体可能通过转移其分子内容来重塑肿瘤行为。MIR-16富含于MSC来源的外切体中，并通过靶向血管内皮生长因子(VEGF)发挥部分抗血管生成作用。

长链非编码RNA(LncRNAs)在操作上被定义为超过200个核苷酸的转录本，其功能没有明显的蛋白质编码功能。LncRNAs存在于细胞核或细胞质中，它们可以与DNA、RNA或蛋白质相互作用。值得注意的是，lncRNAs被证明通过直接或间接干扰各种癌症的基因表达，在多种生物学过程中发挥重要作用。lncRNA也可以包装成外切体，在细胞间的通讯中充当信使。值得注意的是，一些lncRNAs富集在外体中，而另一些几乎不存在，这表明一些lncRNAs选择性地分选到外体中。特定蛋白可能作为基本的lncRNAs载体来控制lncRNA分选成外体，但其确切的调控机制尚未完全阐明。

孙尼替尼耐药的肾癌细胞中基于lncARSR信号通路的基本原理。通过竞争性结合miR-34和miR-449，导致Axl/c-met的表达增加，重新激活STAT3、AKT和ERK信号，从而促进了对Sunitinib的耐药性。反过来，激活AKT诱导FOXO1或FOXO3a的磷酸化和降解，导致lncARSR的转录去抑制，从而形成一个正反馈环。此外，lncARSR可以被包装成外体，并从对孙尼替尼耐药的肾癌细胞中分泌出来，将耐药性转移到受体敏感的细胞中。

5.外泌体和免疫系统

炎症相关癌症发展过程中先天和适应性免疫细胞功能的模型。早期肿瘤组织中存在的抗原通过树突状细胞(DC)转运到淋巴器官，激活适应性免疫反应，从而产生促肿瘤和抗肿瘤作用。在癌症早期发展过程中调节DC运输的途径和抗原的确切性质仍有待确定。B细胞的激活和体液免疫反应导致肿瘤组织中天然免疫细胞的慢性激活。激活的先天免疫细胞，如肥大细胞、粒细胞和巨噬细胞，通过释放有效的促进生存的可溶性分子来促进肿瘤的发展，这些分子调节启动的肿瘤细胞中的基因表达程序，最终改变细胞周期进程，提高存活率。炎症细胞通过产生促血管生成介质和胞外蛋白酶，积极影响组织重构和血管生成的发育。这些通路长期参与的组织显示肿瘤发展的风险增加。相反，适应性免疫的激活除了抗体依赖的细胞介导的细胞毒性和抗体诱导的补体介导的溶解外，还通过T细胞介导的杀伤(通过诱导Fas、穿孔素和/或细胞因子途径)来诱导抗肿瘤反应。

TES在肿瘤免疫环境中的作用。a)TES呈递肿瘤抗原，增强抗肿瘤免疫：在树突状细胞存在的情况下，负载特异性抗原的TES能够促进肿瘤抗原特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞的活化。热休克蛋白70表面阳性的TES能刺激NK细胞和巨噬细胞的迁移和溶细胞活性。b)在大多数情况下，TES作为免疫抑制因子发挥作用。例如，含有FasL或TRAIL的TES诱导T细胞凋亡，抑制T细胞活化。携带转化生长因子-β的TES促进T细胞增殖，从而抑制免疫应答。表达NKG2D配体或转化生长因子β1的TES可通过下调NK细胞和CD8T细胞表面NKG2D的表达来抑制NK细胞和CD8T细胞的细胞毒作用。携带HSP72基因的TES能激活MDSCs中的STAT3，促进MDSCs的抑制功能。含有miR-21-3p、miR-125b-5p、miR-181D-5p和miR-1246等miRNAs的TES将巨噬细胞重塑为促进肿瘤的表型。

来自不同免疫细胞的外切体在调节癌症免疫中发挥着不同的作用。a)携带MHC II的B细胞来源的外切体激活CD4+T细胞。DC来源的外切体含有肿瘤来源的抗原、共刺激分子和蛋白质，可以促进CD4+T细胞和CD8+T细胞的活化。携带MHC I的巨噬细胞来源的外切体可以被转移到DC，从而使其能够激活抗原特异性的CD4+T细胞。b)含有CD73的T-reg来源的外切体可以抑制T细胞的活化。携带MHCⅠ的CD8+T细胞来源的外切体也通过抑制DC的抗原提呈来介导免疫抑制。

外泌体在癌症免疫治疗中的应用。a)由于外泌体在循环中的稳定性高，具有良好的水平载物转运能力，已被探索作为药物或肿瘤靶向RNAi在不同疾病中的递送载体。此外，外泌体还可以通过表达SIRPα、PD1或肿瘤抗原肽等蛋白作为免疫调节剂。树突状细胞、巨噬细胞和CD8+T细胞等免疫细胞来源的外体可激发抗肿瘤免疫反应。重要的是，为临床应用产生了大规模的良好制造规范级别(GMP级别)和临床级别的外泌体。b)携带GPC1、PD-L1或某些miRNA的外泌体可能是有价值的癌症生物标志物。c)抑制外泌体的生物生成、释放和摄取是癌症免疫治疗的另一个策略。

三.外泌体热点研究分析

外泌体是近年来生物医学领域的研究热点，其在人体内广泛分布，几乎所有细胞均可以分泌外泌体，这些外泌体既有共性也有区别，但来源于不同细胞的外泌体在不同的生理、病理阶段具有不同的功能。随着研究的不断深入，人们对外泌体的认识一直在快速增长。与其他任何一个相对较新的领域一样，外泌体是一种令人兴奋的生物现象，充满了希望和疑惑。

从近几年国自然的申报情况来看，外泌体相关领域研究越来越多，大家对外泌体的研究愈发重视，自2010年开始，国自然审批通过的外泌体方向的研究逐渐增加，趋势上来看外泌体研究已经成为国自然热门研究方向，本期拟通过分析近几年外泌体研究的热门研究方向向大家说明外泌体研究的策略以及未来重点研究方向的走向，帮助大家更好的完成相关领域的研究。

1.外泌体肿瘤耐药性研究

化疗是肿瘤的主要治疗方法之一，在控制肿瘤进展方面发挥着重要作用。然而,化疗药物的长期应用通常会诱导肿瘤细胞对药物产生耐药性，从而导致治疗失败和疾病进展。因此，肿瘤耐药的机制及耐药预防或逆转策略一直是肿瘤治疗研究的热点问题。外泌体(exosomes)是机体细胞分泌的一种直径在40～100 nm之间的小球形囊泡，携带多种生物活性小分子(DNA,ncRNA,mRNA,蛋白质等)，参与细胞微环境的调节,从而调控体内多种生理和病理活动。近年来研究表明，外泌体作为细胞-细胞间耐药信号传递的媒介,在肿瘤化疗耐药，转移及免疫逃逸等方面发挥重要作用。大多数关于肿瘤耐药性的研究都集中在肿瘤细胞本身。由肿瘤细胞分泌的外泌体充当了肿瘤细胞之间或者微环境中的各类细胞之间通信的关键介质。因此，外泌体已成为肿瘤耐药性研究的新模式，也成为了肿瘤生物学耐药性研究的新热点。

案例分析：

背景：奥沙利铂耐药是晚期结直肠癌(CRC)治疗的主要挑战。上皮-间充质转化(EMT)的获得和肿瘤细胞内药物积聚的抑制都有助于奥沙利铂耐药的发展。小分子非编码RNA miR-128-3p的异常表达在肿瘤的发生和发展中起着关键的调节作用。然而，它在大肠癌进展和奥沙利铂耐药中的作用在很大程度上还不清楚。

方法：将miR-128-3p表达的慢病毒转染奥沙利铂耐药的大肠癌细胞和正常肠道FHC细胞。转染后分离FHC来源的外切体，与CRC细胞共培养。用实时定量PCR(RT-qPCR)检测耐药大肠癌细胞、FHC细胞和外体中miR-128-3p的表达。RT-qPCR和Western blot分别检测耐药细胞miR-128-3p靶基因的mRNA和蛋白水平。采用CCK8、流式细胞仪、Transwell和伤口愈合试验、免疫荧光和原子吸收分光光度计检测miR-128-3p对大肠癌细胞存活率、凋亡率、EMT、运动能力和药物外排的影响。采用异种移植模型，观察负载miR-128-3p的外切体在体内是否能使大肠癌细胞对奥沙利铂再增敏。

结果：在我们建立的稳定的奥沙利铂耐药的大肠癌细胞系中，体内外研究显示miR-128-3p抑制EMT，增加奥沙利铂在细胞内的蓄积。重要的是，我们的结果表明，在晚期人类大肠癌患者中，miR-128-3p的低表达与奥沙利铂疗效差有关。此外，数据表明，转染miR-128-3p的FHC细胞能有效地将miR-128-3p包装成分泌型外泌体，并介导miR-128-3p转运到奥沙利铂耐药细胞，提高了奥沙利铂对大肠癌细胞的体内外反应。此外，miR-128-3p过表达通过抑制耐药细胞中Bmi1的表达，上调E-cadherin水平，抑制奥沙利铂诱导的EMT。同时，通过抑制药物转运蛋白MRP5的表达，减少奥沙利铂的外排。

结论：结果表明，通过外切体传递miR-128-3p是一种通过负调控Bmi1和MRP5来增强大肠癌化疗敏感性的新策略。此外，miR-128-3p可能是奥沙利铂为主的化疗的一个有前途的诊断和预后标志物。

大肠癌治疗中基于外体miR-128-3p的信号通路示意图。在奥沙利铂耐药的CRC细胞中，来源于FHC-128细胞的外体miR128-3p通过竞争性结合Bmi1和MRP5来逆转奥沙利铂耐药，导致E-cadherin表达增加(抑制EMT表型)，减少奥沙利铂外排。

2.外部干预刺激型外泌体研究

案例分析：

背景：转移是肺癌死亡的主要原因。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是癌症微环境的一个组成部分，对癌症的发展起着重要作用。肿瘤内缺氧对癌细胞和间质细胞都有影响。胞外体被认为是细胞间通讯的媒介。在这里，我们的目标是进一步阐明BMSC来源的外切体与缺氧生态位中的癌细胞之间的联系。

方法：使用microRNA阵列进行外体miRNA图谱分析。采用肺癌细胞和小鼠体内同基因肿瘤模型，评价选择性外体microRNAs的作用。评估了低氧骨髓间充质干细胞来源的血浆外体miRNAs区分癌症患者和非癌症对照以及有或没有转移的癌症患者的能力。

结果：我们证明了低氧骨髓间充质干细胞来源的外切体可以被邻近的癌细胞摄取，并促进癌细胞的侵袭和EMT。Exosome介导的包括miR-193a-3p、miR-210-3p和miR-5100在内的特定microRNAs从BMSCs转移到上皮癌细胞可以激活STAT3信号，增加间质相关分子的表达。单个microRNA的诊断准确性表明，血浆外体miR-193a-3p可以区分癌症患者和非肿瘤对照。这三组血浆胞外体microRNA对肺癌患者有无转移的诊断准确率比单独的胞外体microRNA更高。

结论：Exosome介导的miR-193a-3p、miR-210-3p和miR-5100基因转染可通过激活STAT3信号诱导的EMT促进肺癌细胞的侵袭。这些外体miRNAs可能是癌症进展的有前途的非侵入性生物标记物。

BMSCs外体miRNAs通过STAT3介导的EMT促进肿瘤转移。C57BL/6小鼠皮下注射LLC-RFP(含或不含骨髓间充质干细胞)。通过流式细胞仪细胞分选，从肿瘤部位收集红色荧光蛋白阳性的LLC细胞，进行RNA测序分析。上调的基因在JAK-STAT途径中富集。对从接受BMSCs联合注射和LLC或LLC单独注射的小鼠收集的LLC细胞之间的差异表达的mRNA进行聚类。直方图显示RNA-Seq获得的STAT3转录本的FPKM。Western blot检测STAT3、p-STAT3的B蛋白表达。用常氧的BMSC分泌的外切体或缺氧的BMSC分泌的外切体处理细胞。以β-肌动蛋白作为内对照。用Transwell法测定C细胞侵袭力。STAT3抑制剂他汀类药物可逆转缺氧BMSC分泌的外切体增加的侵袭能力。放大倍率为100倍。用实时定量PCR检测Snail和Vimentin的D表达。细胞用缺氧的BMSC分泌的外切体加或不加STAT3抑制剂他汀类药物处理。

3.外泌体磷酸化，泛素化机制研究

案例分析：

肿瘤细胞分泌的外泌体参与了肿瘤间质环境的重塑和促进恶性肿瘤的发生。然而，控制肿瘤外切体释放的机制仍然不完全清楚。在这里，我们发现肿瘤细胞外泌体的分泌是由丙酮酸激酶M2(PKM2)控制的，该蛋白在肿瘤中被上调和磷酸化。在胞外体分泌过程中，磷酸化的PKM2作为蛋白激酶磷酸化突触体相关蛋白23(SNAP-23)，进而形成SNARE复合体，使胞外体释放。直接磷酸化实验和质谱分析证实PKM2在Ser95位磷酸化SNAP-23。非磷酸化SNAP-23突变体(Ser95-Ala95)的异位表达显着减少了PKM2介导的外切体释放，而选择性拟磷酸化SNAP-23突变体(Ser95-Glu95，而不是Ser20-Glu20)的表达则挽救了PKM2基因敲除引起的受损的外切体释放。我们的发现揭示了PKM2的非代谢功能，PKM2是一种与肿瘤细胞对有氧糖酵解的依赖相关的酶，在促进肿瘤细胞外切体释放方面起着重要作用。

肿瘤细胞外切体的释放依赖于有氧糖酵解。(a-c)用透射电镜(a)、WB(b)和NTA(c)鉴定从A549细胞中分离的外泌体。a中右下角的图像代表外泌体中CD63的免疫金标记物。肿瘤细胞比非肿瘤细胞释放更多的外泌体。(e)外泌体分泌与有氧糖酵解呈正相关。(f)葡萄糖摄取量与乳酸水平之间的线性回归。(g)外泌体的释放依赖于细胞的有氧糖酵解。用紫草素(1 μM)或肿瘤坏死因子a(5 ngml-1)处理细胞，以抑制或促进有氧糖酵解。治疗24 h后测定外切体浓度。(h)EGF和OA对细胞有氧糖酵解的影响。值得注意的是，EGF(10 ngml-1)，外切体释放的促进剂，增加有氧糖酵解，而OA(10 mgm-1)，外切体释放的抑制剂，减少有氧糖酵解。(i)EGF和OA通过改变细胞有氧糖酵解来调节A549细胞外切体的释放。数据以平均值±S.E.M表示。并且表示每个数据点具有三个重复的至少三个独立实验。

4.外泌体分选及分泌机制研究

案例分析：

苏尼替尼耐药是晚期肾细胞癌(RCC)面临的主要挑战。了解苏尼替尼耐药的潜在机制，制定有效的抗耐药策略，是临床上迫切需要解决的问题。在这里，我们发现了一个lncRNA，命名为lncARSR(在具有苏尼替尼耐药的肾癌中激活的lncRNA)，它与临床上较差的苏尼替尼反应相关。LncARSR通过竞争性结合miR-34/miR-449促进AXL和c-met在肾癌细胞中的表达，从而促进对舒尼替尼的耐药性。此外，生物活性的lncARSR可以被整合到外切体中并传递给敏感细胞，从而传播对孙尼替尼的耐药性。靶向incARSR或axl/c-met抑制剂的锁定核酸治疗对舒尼替尼耐药的肾癌恢复了舒尼替尼的反应。因此，lncARSR可作为舒尼替尼耐药的预测指标和潜在的治疗靶点。

lncARSR的鉴定及其对苏尼替尼耐药的影响。(A)描述获得对苏尼替尼耐药的肾癌细胞过程的示意图模型。(B)左：耐舒尼替尼细胞和亲本细胞的lncRNA微阵列数据显示在热图中。右图：指示样本中非调控LncRNA筛选流程图。(C)人类染色体9q82.120.717-82.185.824上lncARSR基因组位点的示意图注释。绿色矩形代表外显子。(D)用LNA探针对Sonitinib抗性细胞和亲本细胞中的lncARSR进行Northern blot分析。以B-肌动蛋白作为载药对照。(E)定量RT-PCR分析复发组(9例)、新辅助组(12例)和初治组(8例)肾癌组织中LncARSR的表达。将lncARSR表达归一化为b-actin(DCT)，并与最大DCT进行比较。数据以？DDCT表示。(F)在舒尼替尼治疗前(治疗前)和在舒尼替尼治疗期间疾病进展之后(复发后)，用LNA探针对配对的肾癌组织中的lncARSR进行LNA ISH分析。

5.外泌体功能机制研究

胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要病理特征，老年人常出现胰岛素抵抗。然而，与衰老相关的胰岛素抵抗的深层次机制仍不清楚。在这里，我们发现老年小鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)释放的纳米外切体可以被脂肪细胞、心肌细胞和肝细胞摄取，导致体内和体外的胰岛素抵抗。通过microRNA(MiRNA)阵列检测，我们发现老年小鼠BM-MSCs释放的外切体miR-29b-3p的数量显著增加。从机制上讲，SIRT1(Sirtuin1)被认为是外体miR-29b-3p调节胰岛素抵抗的下游靶点。值得注意的是，利用适体介导的纳米复合物递送系统下调BM-MSCs来源的外体中miR-29b-3p的水平，显著改善了老年小鼠的胰岛素抵抗。同时，BM-MSCs特异性过表达miR-29b-3p诱导幼鼠胰岛素抵抗。综上所述，这些发现提示BM-MSCs来源的胞外体miR-29b-3p可以调节衰老相关的胰岛素抵抗，这可能成为衰老相关胰岛素抵抗的潜在治疗靶点。

附件：更多信息请查看国自然专题——深度剖析外泌体五大热门研究方向